Результаты выполнения

План НИР 2023 года выполнен, получены следующие основные результаты:

• На основе современных источников подготовлен и издан научный обзор «Жиросодержащие отходы технологий рыбопереработки – объемы, состав, области применения» / О. Я. Мезенова, С. В. Агафонова, Н. Ю. Романенко, В. В. Волков, Н. С. Калинина. – Калининград: Изд-во ФГБОУ ВО «КГТУ», 2023. –182 с. ISBN 978-5-94826-675-6. 
• Впервые для получения жиросодержащего сырья в качестве биотехнологического С-субстрата на основе анализа крупнотоннажных отходов, образуемых на рыбоконсервных предприятиях Калининградской области, выбраны и исследованы три вида отходов: головы копченой балтийской кильки (отходы производства консервов «Шпроты в масле»), головы атлантической скумбрии (отходы производства консервов «Скумбрия натуральная в масле»), внутренности судака балтийского (отходы производства филе и фарша). Исследованы и оптимизированы параметры термического способа извлечения жира из отходов по показателям: выход жира и его качество при варьировании температуры, скорости перемешивания среды и продолжительности обработки. Определено, что температура и продолжительность термического воздействия являются основными факторами, определяющими выход жира, количество которого увеличивается с ростом температуры, однако при этом ухудшается качество вследствие интенсивных гидролитических и окислительных процессов. Качество жира оценено по ключевым (кислотное и перекисное числа) и дополнительным (тиобарбитуровое, анизидиновое, йодное числа и число омыления) показателям. По совокупному анализу показателей качества жиров экспериментально показано, что наиболее благоприятным диапазоном термического воздействия на исследуемое сырье для выделения жира является температура от 70 до 100 °С. Выполненные исследования позволили определить параметры термического метода извлечения жира из трех типов отходов и получить жир при минимально возможных значениях кислотного и перекисного чисел, т.е. максимально сохранить качество. 
• По оптимизированной технологии в Калининградском техническом университете (партнер проекта) наработаны экспериментальные партии трех образцов жира из исследованных отходов рыбопереработки. Определены выход, показатели качества и физико-химические свойства, биохимический и минеральный состав жира, состав жирных кислот липидов, установлены их специфичность и насыщенность. Экспериментальные партии жира переданы Институту биофизики СО РАН, в котором развернуты пионерные исследования применимости полученных жиросодержащих отходов для биотехнологического синтеза целевых продуктов – белка одноклеточных (SCP) и разрушаемых биопластиков (полигидроксиалканоатов, ПГА).
• В Институте биофизики СО РАН проведен отбор штаммов, обладающих высокой липолитической активностью и способностью к росту на жирах из отходов рыбопереработки в качестве единственного источника углерода. Из четырех штаммов из коллекции ИБФ СО РАН, эффективных продуцентов SCP и ПГА, отобраны два наиболее результативных – Cupriavidus necator B-10646 и IBP/SFU-1, обеспечивающих получение наиболее высоких урожаев биомассы клеток на исследованных субстратах. Разработаны питательные среды на основе стандартной солевой среды Шлегеля, содержащие в качестве источника углерода образцы полученного жира. Определены границы физиологического действия источников жира для штаммов и концентрации трех типов жира, обеспечивающие наиболее высокие выходы по урожаю биомассы клеток.
• На основе выявленных границ физиологического действия источников жира и форм источника азота проведены исследования продукционных характеристик культур двух отобранных штаммов при варьировании соотношения углерод/азот в среде. Связано это с тем, что целевые продукты (белок и полимеры) синтезируются в различных условиях (белок на полной питательной среде при условиях, приближающихся к оптимальным, а ПГА – при ограничении роста и конструктивного обмена дефицитом азота). Исследовано влияние на показатели продуктивности по урожаю биомассы, ПГА и «сырого» протеина источника жира и соотношения С/N в широком диапазоне (от 10 до 40). Установлены значения соотношений С/N в среде, обеспечивающие продуктивные процессы синтеза полимеров при лимитировании роста бактерий по азоту, и/или белка одноклеточных на полной питательной среде. Определено внутриклеточное содержание «сырого» протеина (общий азот клетки х 6,25), белка и его аминокислотный состав, который включает такие незаменимые аминокислоты как валин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, треонин, и фенилаланин. Полимер, синтезированный на трех источниках жира, во всех случаях представлен трехкомпонентными ПГА, включающими, помимо доминирующих мономеров 3-гидроксибутирата (3ГБ) (порядка 97-98 мол.%), мономерные единицы 3-гидроксивалерата (3ГВ) от 1,5 до 2,2 мол.% и 3-гидроксигексаноата (3ГГ) 0,4-0,5 мол.%. Образцы ПГА имели высокие значения молекулярной массы (Мв до 660 кДа), порядка 70 % степень кристалличности и разрыв между температурой плавления (159-169 оС) и термической деградации (251-292 оС), не менее 100-130 оС.
• Исходя из того, что важным показателем биотехнологических процессов является полнота использования ростового субстрата, прежде всего углеродного, что напрямую влияет на конечный выход продукта и экономику процесса в целом, исследована динамика и полнота утилизации жировых субстратов в культуре C. necator B-10646. Установлено, что липиды, составляющие 95-96 % в образцах жира из отходов рыбопереработки, утилизируются бактериями в условиях колбочной лабораторной культуры на 50-60 % из жира, полученного из голов копченой кильки и внутренностей судака, и только на 20 % – из жира из голов скумбрии атлантической. При использовании жиров рыбопереработки, имеющих различные насыщенность и соотношение жирных кислот, показана избирательность потребления ЖК клетками: из всех трех жировых субстратов полиеновые ЖК утилизируются в процессах биосинтеза практически полностью, а насыщенные ЖК и моноеновая олеиновая кислота практически не утилизируются, накапливаясь в культуре. Это требует решений для повышения полноты использования жировых субстратов в процессах биосинтеза, что, по нашему мнению, может быть решено через повышение их доступности для клеток через оптимизацию микронизации жировой эмульсии и привлечение ферментеров с повышенными массообменными характеристиками.
• Исследованы способы эмульгирования жировых отходов и получаемых прямых эмульсий масло/вода (М/В) изменением скорости перемешивания и с применением химических эмульгаторов. Найдены параметры перемешивания, позволяющие получать эмульсии с минимальным размером капель, стабильные во времени. Показано влияние скорости эмульгирования жировых субстратов на полноту их усвоения в широких пределах, от 50-55 до 80-85 %. В качестве эмульгаторов исследованы пептиды, полученные в КГТУ путем гидролиза отходов рыбопереработки, представляющие собой тонкодисперсные порошки пептидов, отличающиеся молекулярной массой. Тип пептида влиял на эмульгирование жира и размер капель, при этом все типы полученных эмульсий не обладали длительной стабильностью. В культуре бактерий C. necator B-10646 исследовано четыре химических эмульгатора: твин-80, SDS, кокоглюкозид и кокоилглутамат натрия. Для определения возможного токсического эффекта бактерии выращивали на глюкозе с добавлением в среду исследуемых эмульгаторов. Токсический эффект SDS проявлялся сразу после его добавления в культуру, независимо от дозы. При росте культуры на кокоглюкозиде также наблюдалось ингибирование бактерий. Пригодными эмульгаторами, не оказывающими негативного влияния на бактерии, признаны твин-80 и кокоилглутамат натрия, при добавлении которых концентрация биомассы бактерий в конце культивирования была сопоставима с контролем. Поэтому эти два эмульгатора отобраны для дальнейших исследований, которые продолжатся в 2024 г. согласно плана НИР. 

Оба коллектива – ИБФ СО РАН и партнер проекта КГТУ, выполнили программы НИР в полном объеме, все задачи плана 2023 г. решены. Имеется полная готовность для выполнения программы НИР 2024 года.