Размер:
A A A
Цвет: C C C
Изображения Вкл. Выкл.
Обычная версия сайта
Логин
Пароль
EN

Федеральный исследовательский центр 
«Красноярский научный центр
Сибирского отделения Российской академии наук»

 Федеральный исследовательский центр «Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук»

Федеральный исследовательский центр 
«Красноярский научный центр
Сибирского отделения Российской академии наук»

Модификация обелина заставляет молекулу светиться зеленым светом

22 февраля 2022 г. Институт биофизики СО РАН

Модификация обелина заставляет молекулу светиться зеленым светом

Ученые модифицировали биолюминесцентный белок обелин молекулой искусственного субстрата и заставили его светиться зеленым цветом. Это позволит управлять его свечением и в перспективе применять белок для визуализации живых тканей непосредственно в организме. Результаты исследований опубликованы в журнале Protein Science и выбраны в качестве иллюстрации обложки февральского номера этого издания.

Светящиеся белки давно и активно используются для обнаружения и визуализации различных объектов в биомедицинских исследованиях и диагностике. За годы исследований они были многократно модифицированы для изменения их свойств, например, для повышения интенсивности биолюминесценции или изменения скорости затухания.

Одним из таких белков является обелин, выделенный из морских гидроидных медуз. Этот природный светящийся белок испускает голубой свет, вступая в реакцию с ионами кальция. Его используют в качестве маркерного и визуализирующего белка в молекулярно-биологических исследованиях. Однако для проведения некоторых исследований ему не хватает мощности или возможности свечения в другом спектральном диапазоне.

Ученые ФИЦ «Красноярский научный центр СО РАН», СФУ и Шанхайского технологического университета получили молекулу фотопротеина обелина, связанную с химически синтезированным целентеразином-v. Такой молекулы не существует в природе. Данная модификация позволила «сдвинуть» спектр биолюминесценции обелина из голубого в зеленый. Исследованный комплекс может открыть ученым дорогу к получению новых модифицированных обелинов для биолюминесцентной визуализации тканей в живых организмах.

Для изменения свойств обелина ученые решили использовать молекулу целентеразина-v вместо природного целентеразина. В результате ученые получили модифицированный биолюминесцентный белок — обелин-v, который излучает зеленый свет вместо голубого. При этом эффективность флуоресценции оказалась почти в полтора раза выше, чем у «голубого» обелина. Определив пространственную структуру комплекса обелин-v, исследователи обнаружили, что в молекуле присутствуют изменения в расположении водородных связей, что может влиять на интенсивность и спектр испускания света. Эти данные помогут разработать системы на основе обелина-v, способные визуализировать живые ткани.

На вопросы об исследовании ответила одна из авторов работы – Марина Ларионова, кандидат биологических наук, научный сотрудник Института биофизики ФИЦ КНЦ СО РАН.

На решение какого вопроса или задачи направлено исследование?

Ларионова.jpgМы изучали белок обелин, который относится к фотопротеинам – «светящимся белкам». Обелин был выделен из морских гидроидных медуз, у которых на краю зонтика находятся клетки фотоциты, излучающие голубой свет. Биолюминесценцию гидроидных медуз изучают более 60 лет, и теперь мы знаем, что для свечения необходимо взаимодействие трех компонентов – обелина, природного субстрата целентеразина и кальция. Обелин образует комплекс с молекулой субстрата и остается в готовом к реакции состоянии. Как только комплекс встречает ионы кальция, молекула перестраивается, и запускается химическая реакция с излучением квантов света.

Обелин применяют в исследованиях на клетках животных в качестве индикатора внутриклеточного кальция, а также в лабораторной диагностике для высокочувствительных анализов. Использование обелина для исследований на уровне тканей и лабораторных животных ограничено тем, что его голубой свет поглощается тканями. Для подобных задач предпочтительны белки, испускающие свет в более длинноволновой области, например, в красной. Такой свет легко проникает свозь живые ткани. В быту в этом можно легко убедиться, посветив красной лазерной указкой сквозь мочку уха. Поэтому в нашей работе мы попытались изменить спектр свечения обелина, тем самым расширив спектр его применения в качестве сенсора.

Как можно изменить свойства природного белка?

Для этого в белковой инженерии используют мутагенез, в ходе которого заменяются некоторые ключевые аминокислотные остатки. В случае фермент-субстратных комплексов можно изменять молекулы субстрата. В нашем исследовании мы использовали химически синтезированный аналог субстрата, имеющий в структуре дополнительное бензольное кольцо, целентеразин-v. Данная модификация, хоть и снизила интенсивность биолюминесценции, позволила «сдвинуть» спектр на 55 нм, из голубого в зеленый.

В статье вы презентовали пространственную структуру «зеленого» обелина, как вы определили структуру и для чего?

Спектр биолюминесценции обелина при взаимодействии с целентеразином-v изменяется из-за перестроек внутри активного центра белка, поэтому было важно взглянуть в самое сердце молекулярного комплекса. Подобно тому, как доктор направляет пациента на рентген, не полагаясь на поверхностный осмотр, мы решили применить метод рентгеноструктурного анализа для определения пространственной структуры белка. На первом этапе такой подход требует получения белковых кристаллов. Мы подобрали определенные условия, при которых исследуемые молекулы собирались в упорядоченную структуру, формируя кристаллы. В дальнейшем белковые кристаллы были исследованы на источнике синхротронного излучения третьего поколения SPring-8 в Осаке (Япония). При прохождении через кристалл рентгеновские лучи рассеиваются и фиксируются высокочувствительным детектором. Исследование полученной дифракции рентгеновских лучей позволяет до мельчайших подробностей восстановить пространственную структуру белковой молекулы. В нашем случае структура комплекса обелина-v была определена с высоким разрешением, 1.8 ангстрем. Один ангстрем равен одной десятой нанометра. Эта величина указывает, насколько точно можно рассмотреть детали молекулы – для примера, средний размер одной аминокислоты составляет 3.5 ангстрем, а атома водорода – 1 ангстрем. Рентгеноструктурный анализ помог нам определить точное расположение аминокислот активного центра обелина-v и сделать вывод о факторах, определяющих изменения физико-химических свойств.

Каковы будущие направления этой работы?

Мы изучили трехмерное строение комплекса обелин–целентеразин-v в состоянии до взаимодействия с кальцием, а значит, до начала биолюминесцентной реакции. Сейчас работаем над определением пространственной структуры обелина-v в состоянии после реакции. Это позволит нам построить полную картину внутримолекулярных изменений обелина при взаимодействии с синтетическим субстратом, а также понять, какие мутации аминокислотных остатков в активном центре белка повысят эффективность биолюминесцентной реакции.

Исследование выполнено при поддержке грантов РФФИ № 20-54-53011 (совместно с Государственным фондом естественных наук Китая № 2011530076), РФФИ-ККФН № 20-44-240006, а также РФФИ № 20-04-00085.




Поделиться:



Наверх